杀菌剂对微生物的活性取决于许多因素，其中些是生物体的内在品质，其他的是化学和外部物理环境。意识到这些因素应该能够更好地使用消毒和灭菌过程。对这些和其他因素的更广泛的考虑可在别处获得。
微生物的数量和位置
所有其他条件保持不变，微生物的数量越多，杀菌剂消灭所有这些物质的时间就越多。当他使用相同的测试条件并且证明花费30分钟杀死10个萎缩芽孢杆菌（以前的枯草芽孢杆菌）孢子但3小时杀死100,000个萎缩芽孢杆菌时，Spaulding阐明了这种关系孢子。这加强了在消毒和灭菌之前仔细清洁医疗器械的需要。通过精心清洗，减少必须灭活的微生物的数量，增加按照标签使用杀菌剂时的安全边际，并缩短杀灭整个微生物量所需的暴露时间。研究人员还发现聚集或聚集的细胞比单分散细胞更难灭活。
当评估影响杀菌剂功效的因素时，还必须考虑微生物的位置。由于设备所有部分的消毒剂渗透更加困难，因此必须拆卸多件医疗器械，并且具有缝隙，关节和通道的内窥镜等设备比平面设备更难以消毒。只有直接接触杀菌剂的表面才会被消毒，所以不得有气泡，并且设备必须在整个暴露期内完全浸没。应鼓励制造商生产便于清洁和消毒的设备。
微生物的天然抗性
微生物对化学杀菌剂和灭菌过程的抵抗力差别很大。微生物对消毒剂的内在抵抗机制各不相同。例如，孢子对消毒剂具有抵抗力，因为孢子外壳和皮层起着屏障的作用，分枝杆菌有个蜡质细胞壁，防止消毒剂进入，和革兰氏阴性细菌具有的外膜对消毒剂的吸收起到屏障作用。隐含在所有消毒策略中的是考虑到**具抗性的微生物亚群控制灭菌或消毒时间。也就是说，为了破坏**具抗性的微生物类型（即细菌孢子），用户需要使用暴露时间和实现完全破坏所需的杀菌剂浓度。除了朊病毒之外，细菌孢子对化学杀菌剂具有**高的固有抗性，其次是球虫（例如隐孢子虫），分枝杆菌（例如结核分枝杆菌），非脂质或小病毒（例如脊髓灰质炎病毒和柯萨奇病毒），真菌（例如，曲霉菌和念珠菌），营养细菌（例如葡萄球菌和葡萄球菌）假单胞菌属）和脂质或中等大小的病毒（例如疱疹和HIV）。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌表现出的杀菌抗性与些例外情况相似（例如铜绿假单胞菌对某些消毒剂表现出更大的抗性）。与在实验室培养基上传代的细胞相比，铜绿假单胞菌在其“天然存在”状态下对各种消毒剂的耐受性也明显更强。立克次体，衣原体和支原体不能置于这种相对抗性的范围内，因为关于杀菌剂对这些药剂的功效的信息是有限的。因为这些微生物含有脂质并且在结构和组成上与其他细菌相似，所以它们可以被相同的杀灭脂质病毒和营养细菌的杀菌剂预测灭活。这个假设的个已知的例外是Coxiella burnetti，它已经显示出对消毒剂的抗性。
消毒剂的浓度和效力
在其他变量不变的情况下，除了个例外（碘伏），消毒剂浓度越高，效力越大，实现微生物杀灭所需的时间越短。然而，通常不被认可的是所有消毒剂都不会受浓度调节的类似影响。例如，季铵化合物和苯酚的浓度指数分别为1和6; 因此，季铵化合物浓度的减半需要加倍其消毒时间，但是将苯酚溶液浓度减半需要消毒时间增加64倍（即，26）。
考虑到杀菌时间长短取决于杀菌剂的效力，这点也很重要。斯帕尔丁说明了这点，他们用粘蛋白环测试证明70％异丙醇在5分钟内破坏了104 结核分枝杆菌，而同时使用3％酚类的测试需要2-3小时才能达到相同的微生物杀灭水平。
物理和化学因素
些物理和化学因素也影响消毒程序：温度，pH值，相对湿度和水硬度。例如，大多数消毒剂的活性随着温度升高而增加，但也存在些例外。此外，温度过高导致消毒剂降解并削弱其杀菌活性，因此可能会产生潜在的健康危害。
pH值的增加改善了些消毒剂（如戊二醛，季铵化合物）的抗微生物活性，但降低了其他消毒剂（如酚，次氯酸盐和碘）的抗菌活性。pH通过改变消毒剂分子或细胞表面影响抗微生物活性。
相对湿度是影响气态消毒剂/灭菌剂（如EtO，二氧化氯和甲醛）活性的****重要的因素。
由于硬水中的二价阳离子（例如镁，钙）与消毒剂相互作用形成不溶性沉淀物，水硬度（即二价阳离子的高浓度）降低了某些消毒剂的杀灭速率。
有机和无机物质
血清，血液，脓液或粪便或润滑剂材料形式的有机物可以**少以两种方式干扰消毒剂的抗微生物活性。**常见的是，干扰通过杀菌剂和有机物质之间的化学反应而发生，导致杀菌剂或非杀菌剂较少的复合物，留下较少的活性杀菌剂可用于攻击微生物。尤其氯和碘消毒剂易于发生这种相互作用。或者，有机材料可以通过充当物理屏障来保护微生物免受攻击。
无机污染物对灭菌过程的影响在20世纪50年代和60年代进行了研究。这些和其他研究表明，微生物无机污染物对所有消毒过程的保护作用都是由盐晶体中的阻塞引起的。这进步强调了在任何灭菌或消毒程序之前对医疗器械进行细致清洁的重要性，因为有机和无机污垢通过清洗容易被清除。
曝光时间
必须将物品暴露于杀菌剂中以保持适当的**短接触时间。多名研究人员已经证明低水平消毒剂对营养细菌（例如，李斯特菌，大肠杆菌，沙门氏菌，VRE，MRSA），酵母菌（例如念珠菌），分枝杆菌（例如结核分枝杆菌）和病毒（例如， ，脊髓灰质炎病毒），暴露时间为30-60秒。根据法律，必须遵守EPA注册产品上的所有适用标签说明。如果用户选择与EPA注册产品标签上的暴露条件不同的暴露条件，则用户须承担因标签外使用而导致的任何伤害的责任，并可能受到联邦杀虫剂，杀真菌剂和灭鼠剂法案（FIFRA ）。
内窥镜仪器的所有流明和通道必须与消毒剂接触。气泡会干扰消毒过程，漂浮在消毒剂上的物品不会消毒。消毒剂必须可靠地引入设备的内部通道。由于上述因素对消毒效果的影响，消毒医疗用品的准确时间有些难以捉摸。某些接触时间已被证明是可靠的，但通常较长的接触时间比较短的接触时间更有效。
生物膜
微生物可以通过生产厚质量的细胞和细胞外物质或生物膜而免受消毒剂的侵害。生物膜是紧密附着在表面上的微生物群落，不能轻易去除。旦这些物质形成，它们中的微生物可以通过多种机制抵抗消毒剂，包括较旧的生物膜的物理特性，细菌的基因型变异，中和酶的微生物生产以及生物膜内的生理学梯度（例如pH）。与悬浮液中的相同细菌相比，生物膜内的细菌对抗菌剂的耐药性高达1,000倍。虽然新的去污方法正在研究去除生物膜，氯和氯胺可以有效地灭活生物膜菌。研究人员假设，聚氯乙烯管内壁上的糖萼样细胞团可以保护嵌入的生物体免受某些消毒剂的侵害，并成为持续污染的储存器。生物膜已在漩涡已发现，牙科单元水纹，以及众多的医疗设备（例如，隐形眼镜，起搏器，血液透析系统，导尿管，中央静脉导管，内窥镜）。他们的存在可能会对免疫功能低下患者和留置医疗设备的患者产生严重影响。些酶和去污剂可以降解生物中的生物膜或减少活细菌的数量，但是没有产品是EPA登记的或FDA为此目的批准的。
